La polymerase chain reaction è una tecnica adottata per copiare molte volte in provetta una specifica sequenza di DNA o RNA, partendo anche da quantitativi esigui come una sola molecola. Ad esempio, potrebbe esserci un gene di cui si vuole capire la funzione; o un marcatore genetico usato dagli scienziati forensi per abbinare il DNA della scena del crimine ai diversi sospettati.
In genere, l'obiettivo della PCR è quello di produrre copie di sequenze bersaglio da analizzare o utilizzare in qualche altro modo. il DNA amplificato mediante PCR può essere inviato per il sequenziamento, visualizzato mediante elettroforesi su gel, o clonato in un plasmide per ulteriori esperimenti.
Le molte applicazioni della PCR riguardano genetica molecolare, diagnostica, medicina forense, le analisi alimentari e microbiologiche e gli studi di filogenesi molecolare.
Fu ideata nel 1980 da Kary Banks Mullis e con il tempo si è sviluppata tanto da assumere un ruolo fondamentale nella ricerca.
Come per la replicazione del DNA in un organismo, la PCR richiede un enzima DNA polimerasi che crei nuovi filamenti di DNA, usando fili esistenti come modelli. La DNA polimerasi tipicamente utilizzata nella PCR è chiamata Taq polimerasi, Dal nome del batterio dal quale è stata ottenuta (Thermus aquaticus). La stabilità al calore rende la Taq polimerasi ideale per la PCR.
La DNA polimerasi comincia a produrre solo se ha un primer: una breve sequenza di nucleotidi che fornisce un punto di partenza per la sintesi. In una reazione PCR, il ricercatore determina la regione del DNA che verrà copiata o amplificata dai primer che sceglie.
I primer per PCR sono brevi frammenti di DNA a filamento singolo, di solito intorno ai 20 nucleotidi di lunghezza. in ogni reazione PCR sono usati Due primer, progettati in modo da fiancheggiare la regione bersaglio (quella da copiare).
Gli ingredienti chiave di una reazione PCR sono Taq polimerasi, primer, DNA modello e nucleotidi (blocchi di costruzione del DNA). Gli ingredienti sono assemblati in un tubo, insieme ai cofattori necessari all'enzima, e sono sottoposti a cicli ripetuti di riscaldamento e raffreddamento che consentono di sintetizzare il DNA.
I passaggi fondamentali sono:
Denaturazione (96° C): si riscalda fortemente la reazione per separare o denaturare i filamenti di DNA. Questo fornisce un modello single-strand per il prossimo passo.
Ricottura (55 - 65° C): si raffredda la reazione in modo che i primer possano legarsi alle sequenze complementari sul DNA del modello a filamento singolo.
Estensione (72° C): aumentano le temperature di reazione in modo che la Taq polimerasi estenda i primer, sintetizzando nuovi filamenti di DNA.
Questo ciclo si ripete 25 - 35 volte in una reazione tipica, che in genere richiede da 2 a 4 ore, a seconda della lunghezza della regione del DNA che viene copiata. Se la reazione è efficiente, la regione target può passare da una o poche copie a miliardi.
Infatti non è solo il DNA originale a essere utilizzato come modello ogni volta. Il nuovo DNA può fungere da modello nel prossimo ciclo di sintesi. Ci sono molte copie dei primer e molte molecole di Taq polimerasi che galleggiano nella reazione, quindi il numero di molecole di DNA può raddoppiare all'incirca in ogni ciclo.
PCR e Cannabis
Come abbiamo detto nell'articolo sul sex test, In ogni pianta di Cannabis, sono presenti solo due copie per ogni gene. Per questo usiamo la tecnica della PCR per aumentarne il numero. Nel nostro caso, per identificare il sesso della pianta, occorre amplificare un gene che sia in qualche modo diverso tra ♂ e ♀ così da identificarli precocemente. Estrarremo quindi il DNA da una piccola porzione di germoglio, e amplificheremo le copie dei geni in grado di discriminare il sesso. In seguito, sarà possibile visualizzare, usando particolari sostanze chimiche, i risultati.
I due geni che abbiamo scelto possono indicare il sesso della pianta in base a:
- presenza del risultato di PCR = ♂
- Assenza del risultato di PCR = ♀ (il gene è presente solo sul cromosoma Y)
Oppure in base alla lunghezza:
- Gene con lunghezza maggiore = ♀
- Gene con lunghezza minore = ♂ (il gene nel maschio ha perso una parte, quindi è più corto)
Il maschio sarà facilmente discriminabile, mentre la femmina si potrà sviluppare in un ermafrodita a seconda delle condizioni ambientali e dello stress subito.
Trackbacks/Pingbacks